Научный сотрудник лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН (Красноярск) кандидат биологических наук Елена Владимировна Еремеева получила грант РФФИ на реализацию исследования, посвященного биолюминесцентным белкам. По её словам, работа носит исключительно фундаментальный характер, но полученные знания затем можно будет применять для создания систем диагностики.
Тема будущего гранта звучит так: «Механизм образования эмиттера целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем: спектральные и кинетические исследования». Если говорить простыми словами, то Елена Еремеева планирует изучать вещество, которое излучает свет – эмиттер – в определенном виде белков, использующих целентеразин в качестве субстрата. Её интересует спектральные (почему белок светится определенным цветом) и кинетические (скорость реакции свечения) характеристики.
Конкурс инициативных научных проектов, выполняемых молодыми учеными (Мой первый грант), проводится Российским фондом фундаментальных исследований. Основной задачей организаторы видят привлечение молодых сотрудников к активному участию в научной работе, создание условий талантливым молодым ученым для проведения самостоятельных проектов. Размер гранта фиксированный и составляет 400 000 рублей в год.
— Почему важно знать механизм биолюминесценции? И в частности работу эмиттера?
— Это важно, например, для того, чтобы управлять спектром. Большинство природных биолюминесцентных белков светятся синим цветом, реже встречается зеленый, жёлтый или красный цвет. Однако ученые хотят применять их для своих нужд, в частности для биоимиджинга — визуализации процессов, происходящих в живом организме. Они не токсичны, поэтому у них очень большой потенциал для диагностики: например, с их помощью можно следить за динамикой опухоли у пациента. Но не все природные цвета свечения подходят для этой цели: ткани живого организма плохо пропускают синий и зеленый свет, предпочтительнее будут красные маркеры. Чтобы их получить, нужно понимать, как устроен эмиттер и активный центр белка: тогда мы бы могли изменить спектр, внеся мутацию в белок либо химически трансформировав молекулу субстрата. В результате исследований в данном направлении были выдвинуты гипотезы о механизмах биолюминесценции, и ученые смогли получить ряд цветных мутантных белков с измененной кинетикой реакции, то есть светящиеся быстрее или медленнее природных белков. Например, наша коллега доктор биологических наук Людмила Алексеевна Франк занимается созданием диагностикумов для измерения содержания в крови определенных веществ с помощью таких маркеров.
— В чем достоинство использования светящихся белков в качестве маркеров по сравнению с существующими методами?
— Биолюминесцентные маркеры хороши тем, что это очень чувствительные и обладающие большим линейным диапазоном метки: фотоумножители в люминометрах могут улавливать очень маленькое количество фотонов, поэтому чувствительность выше, чем у стандартных иммуноферментных методов и соизмерима с радиоизотопными. Последние сложно использовать в клинике: необходимо специальное оборудование и меры безопасности, специфические навыки работы. Биолюминесценция проще, но все равно потребует оснащения лаборатории специальными детекторами. Однако сами анализы очень перспективны и интересны, можно даже одновременно измерять разные метаболиты в одной реакции, используя разные цвета свечения.
— Получается: для прикладного применения обязательно знать, как светится белок?
— Некоторые вещи люди используют, исходя из опыта, не всегда зная в деталях, как эта вещь или явление устроено и работает. В быту многие не знают, как функционирует компьютер или телевизор, однако с успехом их эксплуатируют. Так же и ученые: они стали применять светящиеся белки благодаря их очевидной практической пользе и параллельно старались понять, как и почему они функционируют именно таким образом. Так что эти два аспекта могут идти разными, но обязательно пересекающимися путями: изучение механизма и непосредственное применение.
— Какие методы вы будете использовать в исследовании?
— Основной метод, которым я планирую пользоваться в рамках работы по данному гранту, называется метод остановленной струи (stopped – flow). Это метод для регистрации быстрых реакций: он позволяет измерять кинетику в миллисекундном диапазоне. Можно видеть как реагенты и продукты реакции, так и интермедиаты — промежуточные соединения. Мы будем работать вместе с Сибирским федеральным университетом: у нас был совместный мега-грант на создание лаборатории под руководством японского профессора Осаму Симомуры, лауреата Нобелевской премии по химии в 2008 году. В его рамках было приобретено интересное оборудование для исследования биолюминесцентных белков, мы будем его использовать. Конечно, в рамках проекта будут применяться и другие методы.
— Например?
— Например, мутагенез. Мы работаем с рекомбинантными белками, то есть воспроизведенными искусственно, в лаборатории. Их получению предшествует большая работа: сначала находится и клонируется ген светящегося белка, например, из организма медузы. Он помещается в вектор — кольцевую бактериальную ДНК, затем вся конструкция отправляется в бактерию — кишечную палочку — и она начинает синтезировать светящийся белок. Затем мы его выделяем, очищаем и подготавливаем непосредственно к исследованиям. По своим свойствам рекомбинантные белки идентичны или очень близки к своим природным аналогам, но их можно получать в лаборатории в практически неограниченных количествах. После изучения белка дикого типа, то есть встречающегося в природе, у нас появляются гипотезы относительно его работы, и для того, чтобы их проверить, мы можем вносить изменения. Скажем, мы решили, что какая-то часть очень важна, мы изменяем её и смотрим: «сломается» белок или нет, каким образом изменятся его свойства. В арсенале молекулярных биологов есть метод сайт-направленного мутагенеза, соответственно, мы можем вносить изменения в любую точку белка по нашему желанию. Итак, мы получаем мутантный ген, экспрессируем его в клетках бактерий и получаем образец с измененными свойствами. В зависимости от задачи мы можем пытаться улучшить или ухудшить свойства белка: изменить цвет свечения, улучшить стабильность, взаимодействие с субстратом или наоборот, ухудшить эффективность свечения, чтобы определить, какие аминокислоты в составе белка важны для этого процесса.
Стабильность белка – это характеристика, показывающая, как хорошо он хранится и переносит изменения температуры. Многие организмы, из которых выделяют светящиеся белки, обитают в достаточно холодной воде, соответственно, оптимальная температура для их реакции может быть довольно низкая. Например, недавно клонировали образец, для свечения которого оптимальна температура 10°С, однако, применять его планируется в клетках млекопитающих, где гораздо теплее — 37°С. Поэтому очень важно, чтобы белки оставались активными и эффективно светились именно при таких условиях.
— То исследование, которые вы будете проводить в рамках грантах, как-то соотносится с предыдущей вашей работой?
— Темой моей диссертации был механизм образования активного фотопротеинового комплекса, то есть то, как образуется белок, а фактически фермент-субстратный комплекс, готовый к свечению. Тема гранта РФФИ, который я получила в этом году — продолжение жизненного цикла фотопротенов, следующий этап — само свечение.
Подготовила Юлия Позднякова
Фото автора
