Новосибирские ученые из Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН уже четыре года исследуют слезную жидкость. Оказалось, что ее состояние отражает наличие офтальмологических заболеваний, а в самой жидкости, среди белковых агрегатов, можно найти различные компоненты, начиная от впервые обнаруженных биологами «мохнатых» везикул и заканчивая внеклеточными пузырьками — экзосомами.
По какой же причине было решено изучать слезную жидкость? Глаз устроен таким образом, что, не повредив, невозможно из него изъять образец для исследования. Поэтому водянистую влагу (содержится в передней камере глазного яблока) или стекловидное тело у здорового человека просто так не взять — только post mortem, то есть после смерти, либо при травмах. «Чем хороша слезная жидкость? Ее можно собирать много раз и у здорового, и у больного, и изучать характеристики, которые в дальнейшем помогут определить диагностические маркеры офтальмологических заболеваний. Сравнивая материал, собранный у здоровых людей и больных, можно обнаружить различия и понять, какие признаки указывают на развитие болезни», — рассказывает аспирантка ИХБФМ СО РАН Алина Евгеньевна Григорьева.
Слезная жидкость на поверхности глаза человека организована в сложную структуру — трехслойную пленку. Самый верхний слой — липидный, в середине — водно-белковый, а ближайший к роговице — муциновый (слизистый). Однако что происходит с пленкой в процессе слезоотделения, попадают ли компоненты пленки в выделяющуюся слезную жидкость, учеными не выяснено. Отчасти это связано с методами забора слезной жидкости, которые не позволяют сохранить слезную пленку в ее нативном (изначальном) состоянии: слезоотделение стимулируют порошком альбуцида — этот метод был разработан в МНТК «Микрохирургия глаза», сотрудники которого принимают активное участие в исследованиях ИХБФМ СО РАН. Данный метод для пациента совершенно безопасен и может осуществляться многократно. Получаемого материала достаточно, чтобы изучать его методами биохимии и молекулярной биологии. Исследователями из этой офтальмологической клиники опубликованы данные об изменении уровня цитокинов (пептидных информационных молекул) в слезной жидкости при развитии первичной открытоугольной глаукомы и диабетической ретинопатии.
В ИХБФМ СО РАН впервые изучили слезную жидкость в просвечивающем электронном микроскопе. Оказалось, в ней содержится большой набор структур, строение которых изменяется в зависимости от состояния органа зрения. Для электронно-микроскопического исследования слезную жидкость разделяют центрифугированием на супернатант (надосадочную жидкость) и осадок. Каплю супернатанта сорбируют на медную сеточку, покрытую тонкой полимерной пленкой. Этот способ позволяет исследовать взвешенные в слезной жидкости объекты, чей размер не превышает нескольких микрометров, а также увидеть структуру их поверхности. Однако биологические материалы электоронно-прозрачны, поэтому перед помещением в электронный микроскоп их контрастируют веществами, содержащими ионы тяжелых металлов, например, уранил ацетатом или фосфорновольфрамовой кислотой. Осадок, полученный при центрифугировании слезной жидкости, изучают методом ультратонких срезов — тогда появляется возможность увидеть внутреннее строение объекта. Перед этим его подвергают обезвоживанию и заливают в специальную смолу. Образец оказывается надежно «упакованным» и готовым к нарезке на ультратоме, специальном приборе, на котором делаются срезы толщиной около 70 нанометров, а это практически в полторы тысячи раз тоньше, чем лист бумаги А4 (0,1 мм).
Слезная жидкость ранее не изучалась под электронным микроскопом, поэтому в процессе работы не обошлось без сюрпризов. Когда ученые впервые исследовали образцы, то не ожидали, что при центрифугировании будет образовываться значимый по размеру осадок. Оказалось, в нем присутствуют даже целые клетки. «В супернатанте мы обнаружили агрегаты белков различной морфологии. Было выделено три основных типа, встречающихся практически в каждом из более чем ста просмотренных образцов», — отмечает Алина Григорьева.
Среди обнаруженных в осадке клеток — эпителиоциты и лейкоциты. По словам исследовательницы, их существование в слезной жидкости легко объяснимо. Связано это с тем, что слезная пленка тесно контактирует с поверхностью эпителия роговицы и конъюнктивы, как известно, эпителиальные клетки имеют свойство обновляться, в процессе чего слущиваются и могут попасть в слезную жидкость. Нейтрофилы и лимфоциты (разновидности лейкоцитов) всегда присутствуют в эпителиальной ткани. Это клетки иммунной системы: они защищают эпителий и также могут попасть в собираемую жидкость.
Важнейшей находкой сибирских исследователей стало обнаружение в слезной жидкости так называемых «мохнатых» везикул особой морфологии, ранее не замеченных ни в одной из биологических жидкостей. Предположительно, они представляют собой отшнуровавшиеся (отделившиеся) участки микроворсинок эпителиальных клеток. Особенность этих везикул заключается в том, что мембрану насквозь пронзают белковые нити. Содержание «мохнатых» везикул в слезной жидкости здоровых и больных людей различается. Вероятно, это связано с развитием деструктивных изменений эпителиальных клеток в ходе офтальмологических заболеваний.
Исследование слезной жидкости под электронным микроскопом позволило впервые получить прямые доказательства присутствия в ней экзосом. По морфологическим характеристикам экзосомы — это везикулы округлой формы, имеющие размер до ста нанометров. Их роль в функционировании организма активно обсуждается международным научным сообществом. «Экзосомы — очень сложные структуры. Они присутствуют во всех биологических жидкостях, что дает основание считать их важнейшими элементами межклеточной коммуникации. Однако все предположения о функциях экзосом пока находятся на уровне гипотез», — объясняет Алина Григорьева. Экзосомы обнаружены в слюне, спинномозговой жидкости, крови, моче, грудном молоке. Работа новосибирских ученых показала, что они также присутствуют в слезной жидкости.
Чтобы отделить экзосомы от прочих компонентов, исследователи используют метод последовательных центрифугирований: сначала на маленькой скорости, чтобы осадить клетки, потом — чуть больше, чтобы избавиться от клеточного детрита, затем — ультрацентрифугирование осаждает экзосомы, но вместе с некоторыми белками, которые не устранились на предыдущих этапах. Дополнительно используется отчистка препаратов через фильтр с размером пор сто нанометров, задерживающий крупные везикулы. С помощью электронной микроскопии было показано, что метод последовательных центрифугирований обеспечивает удаление содержащихся макромолекулярных агрегатов (крупных полимеров) и частиц детрита. В полученных на последней стадии очистки образцах в электронном микроскопе наблюдаются только везикулы и микрочастицы.
Чтобы доказать природу экзосом в образцах, полученных из слезной жидкости, ученые подвергали их иммуноцитохимическому анализу, то есть выявляли определенные рецепторы на поверхности везикул с помощью специфических антител. Для этого образцы экзосом сначала инкубировали с первичными антителами, которые связываются с молекулой-мишенью, а потом — сами первичные антитела соединяли со вторичными, конъюгированными (сопряженными) с наночастицами золота. Исследование под электронным микроскопом показало, что в образцах слезной жидкости и здоровых, и больных людей содержатся везикулы, которые имеют на поверхности наночастицы золота. Соответственно, они содержат и определенные молекулы, например CD63, которые считаются основным маркером экзосом.
При исследовании других жидкостей: крови, мочи и грудного молока, ученым удалось обнаружить, что кроме везикул в образцах, полученных методом последовательных центрифугирований, присутствуют еще и другие компоненты, в частности микрочастицы (белковые агрегаты). Считается, что это серьезная проблема исследования. Из-за примесей нельзя утверждать, что именно везикулы, а не белковые агрегаты, обеспечивают тот или иной эффект. Обнаружение микрочастиц во всех образцах экзосом — один из самых важных результатов работы. Стоит отметить, что только электронная микроскопия позволяет однозначно определить состав и природу примесей, находящихся в образцах.
«Экзосомы, содержащиеся в разных биологических жидкостях, не различаются по морфологии — они одинаково представляют собой округлые везикулы. Однако находятся отличия по молекулярному составу, сейчас в этой области ведутся наиболее активные исследования. Мы считаем, экзосомы слезной жидкости могут стать источником именно молекулярных маркеров офтальмологических заболеваний», — рассказывает Алина Григорьева.
Поиск таких маркеров в составе экзосом является одним из активно развивающихся направлений современной науки, однако не стоит недооценивать диагностический потенциал именно слезной жидкости. Исследования продолжаются, и, учитывая уже накопленные знания, можно предположить, что на их основе могут быть разработаны принципиально новые подходы к диагностике офтальмологических заболеваний.
Елена Ситникова
Фото: из открытых источников (анонс), предоставлено Алиной Григорьевой (1), Дианы Хомяковой (2)
