На прошлой неделе Нобелевский комитет огласил имена лауреатов премии 2014 года. Награда в области химии была присуждена троим ученым: Эрику Бетцигу и Уильяму Морнеру (США) и Штефану Хеллю (Германия) за развитие флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Методология, которую разработали лауреаты, позволяет наблюдать за живыми организмами мельчайших размеров. Их вклад в науку прокомментировала доктор биологических наук, Елена Ивановна Рябчикова (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН).
Зрение – это главный источник информации о мире. Уже полтысячи лет люди используют разные способы увидеть, как живут самые маленькие существа. Первый микроскоп был создан в 1590 году Иоанном Липперсгеем и Захарией Янсеном: трубка с двумя линзами, не на много увеличивала объекты — всего в 3 10 раз, но в дальнейшем последовательно изобретались различные системы таких аппаратов.
В 1680 году Антони ван Левенгук представил миру свой прибор. Его подносили к глазу, и через маленькую дырочку, где располагалась линза, можно было увидеть объект — капельку на кончике иглы. Микроскоп голландца интересен тем, что именно через него натуралист открыл для мира микроорганизмы. Одновременно с Левенгуком в XVII веке работал Роберт Гук, первый увидевший клетку в созданный им прототип современного устройства.
Развитие микроскопов тесно связано с методами изготовления линз. Всем известны имя Карла Цейса — немецкого инженера и промышленного производителя оптики — и его первый микроскоп-штатив.
С момента создания первых приборов принцип их работы не изменился: объектив, снимающий картинку, предметный столик, куда помещается объект, и система линз. В бинокуляры мы разглядываем изображение. Однако современные микроскопы сложнее своих предшественников. У них и осветитель спрятан, и есть не один объектив, который обеспечивает увеличение.
После краткого экскурса в историю микроскопии Елена Рябчикова объяснила основную разницу между современными приборами:
— Принципиальным является то, что устройства делятся по источнику освещения. Одни работают с лампой накаливания, в других заложена система ультрафиолетового света. На первый взгляд они выглядят одинаково, но у последних отличается оптика, она кварцевая: ведь стекло не пропускает ультрафиолет. Существует также система защиты исследователя, чтобы он не повредил глаза. Нобелевская премия 2014 года связана именно с такими микроскопами.
У любого оптического прибора есть разрешающая способность – это расстояние, когда две точки не сливаются. Оно определяет качество изображения.
— Неправильно считать, что лауреаты этого года перекрыли предел разрешения светового микроскопа. Это не совсем верно, потому что оно зависит от длины волны, которая идет из осветителя. У видимого человеческим глазом света волна длиннее, чем у ультрафиолета, соответственно, и расстояние между двумя точками больше, — подчеркивает Елена Рябчикова.
Для видимого спектра максимальное разрешение не может быть выше 200-350 нанометров (0,2-0,35 микрометров). Пределы для невооруженного глаза составляют 200-80 мкм (средняя толщина волос ~100 мкм), когда для ультрафиолетового света — 130-140 нм.
Работа нобелевских лауреатов была направлена на увеличение четкости, но не за счет преодоления предела, а другими способами.
— Как выглядит традиционная микроскопия при ультрафиолетовом свете? Когда мы не включили лазер, мы не видим на стеклышке бактерии, хотя они есть. Включаем его, и идет свечение, потому что длина волны переходит в видимую. Если мы будем брать светящиеся объекты, они могут определяться разными цветами, — поясняет Елена Рябчикова.
Ученые не сделали нового прибора, но вывели научные принципы, на основе которых микроскопия стала лучше.
Штефан Хелль давно занимается флуоресцентной микроскопией. Свою первую статью он опубликовал еще в 1994 году. В ней ученый объяснил, что, когда мы освещаем ультрафиолетом объект, например, бактерию, создается дифракция — изображение размыто. Вдобавок, возникает паразитическое свечение: стекло или среда, в которой находится объект, могут отдавать блики, и для флуоресцентной микроскопии избавиться от этого эффекта — чрезвычайно важная задача. Что придумал Хелль? Он разработал систему, в которой берется очень маленькая площадь и высвечивается одним лазером, а второй гасит флуоресценцию по периметру пятна. Имея небольшие размеры, такой зонд перемещается по объекту, и в итоге из ярких пятен формируется изображение.
Уильям Морнер стал первым, кто сумел измерить излучение одной молекулы. Это была сложная задача. Самое главное — он понял, на каком расстоянии должны располагаться частицы в объекте, чтобы они потом не слились. Действие принципа таково: одна молекула фотографируется, компьютер четко запоминает, где она находится в препарате, потом переходит к следующей частице. В итоге собирается множество точек, из которых складывается изображение. Это кропотливая работа, и на практике важен не столько микроскоп, сколько реагенты и компьютерная «поддержка».
Чтобы получить четкие картинки, нужно сочетание множества факторов. Конечно, все зависит от конструкции самого прибора, от того, какая оптика в него встроена. Не в каждом есть лазеры, которые дают весь спектр излучения. Естественно, программное обеспечение должно быть сложным и одновременно устойчивым, чтобы любой пользователь мог с ним работать.
Открытие в области химии, смежное с флуоресцентной микроскопией— обнаружение белка GFP (зеленый флуоресцирующий белок). Он был найден в медузе Aequorea victoria: хотя сама она прозрачное, у нее есть фотоорган, светящийся от вспышки камеры. В этом органе находится скопление клеток, способных светиться зеленым светом. Ученые прочитали последовательности аминокислот в белке и синтезировали соответствующий ген. Теперь GFP можно прицепить к другому гену, и когда он будет действовать, появится зеленое свечение.
Флуоресцентная микроскопия широко используется в исследованиях, проводимых лабораториями СО РАН. В Институте цитологии и генетики действует Центр коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов, на его базе проводятся работы методами флуоресцентной микроскопии. В основном, через прибор наблюдают за хромосомами. В ИХБФМ изучаются онкопротекторные свойства белка лактаптина, который позиционируется как противоопухолевый реагент, и его взаимодействие с раковыми клетками.
— Тенденция современной молекулярной биологии — визуализировать те биохимические процессы, которые происходят в клетках, — заключает Елена Ивановна.
Ультрафиолетовую микроскопию применяют в исследованиях и в медицине, и в биологии уже 50 лет. Открытие новых методов учеными Эриком Бетцигом, Уильямом Морнером и Штефаном Хеллем подтвердило общее направление в современной науке.
Полина Гостева
Фото: анонс, (2, 3) — из презентации Е.Рябчиковой, (1) — Е.Пустоляковой
